La citología cervicouterina en base líquida y la genotipificación del Papiloma Virus Humano

La citología cervicouterina en base líquida y la genotipificación del Papiloma Virus Humano (VPH) para el tamizaje y prevención del cáncer de cérvix

Autores:

Laura Tapia Vela* Jairo A. Mesa Arango**

*Jefe de Patología Anatómica, Médica Patóloga, Laboratorio Clínico Hematológico S.A. Medellín, Colombia.

** Científico de Laboratorio Molecular, PhDc en biología, Laboratorio Clínico Hematológico S.A. Medellín, Colombia.

El cáncer cervicouterino es una importante problemática de salud pública, que representa aproximadamente 530.000 casos nuevos por año y la gran mayoría de los casos de cánceres atribuibles al virus del papiloma humano (VPH) en el mundo (1). En cifras publicadas para el año 2012, se reportaron 528.000 casos nuevos de la enfermedad y 266.000 muertes, ocurridas, en su mayoría (~90%), en mujeres con ingresos bajos o medianos y provenientes de países en vía de desarrollo, con problemas de acceso a servicios de diagnóstico y tratamiento oportunos. En países desarrollados, las tasas de cáncer cervicouterino reportadas para los tres últimos decenios muestran una disminución significativa, en gran medida, como resultado de los programas de tamizaje que permiten la detección temprana y el manejo adecuado de la enfermedad (2).

En Latinoamérica, el cáncer cervicouterino corresponde a la segunda causa de cáncer en mujeres, después del cáncer de mama. En Colombia, el comportamiento es similar, lo que ha llevado a que se adopten medidas para la reducción del cáncer cervicouterino, tales como la tamización en mujeres mayores de 30 años con la prueba de detección del ADN de los VPH de alto riesgo y la realización de la citología cervicouterina, como método de triage en pacientes con prueba de VPH positiva. Así mismo, con los programas de vacunación preventiva contra la infección por los genotipos de de alto riesgo del VPH (3). A pesar de la disminución progresiva del número de casos reportados de la enfermedad, para el año 2018 se reportaron 3.853 casos nuevos y un estimado de 1.775 muertes, lo que indica la persistencia de la enfermedad en nuestro medio (4–7).

La citología cervicouterina y la prueba de ADN para VPH son consideradas actualmente los métodos de tamizaje más eficientes para la detección de las lesiones premalignas de cuello uterino y de los genotipos de alto riesgo de VPH, respectivamente, siendo ambas, herramientas de intervención temprana encaminadas a reducir la incidencia y tasa de mortalidad debidas al cáncer de cuello uterino. Por lo anterior, en los sistemas de salud alrededor del mundo se han establecido algoritmos de tamización basados en estas pruebas, al igual que protocolos estandarizados de seguimiento y tratamiento, con el fin de lograr una alta cobertura (8).

El cáncer cervicouterino LHC

Acorde con lo anterior, las políticas nacionales de salud en nuestro país determinan priorizar las acciones dirigidas a la promoción de factores protectores, el fomento del autocuidado mediante la realización de la citología cervicouterina en servicios de salud de alta calidad, la continuidad en los procesos de diagnóstico y/o tratamiento, y el estricto seguimiento por parte de personal médico capacitado (3).

Virus del Papiloma Humano (VPH)

Hasta la fecha se han descrito cinco géneros de VPH, 49 especies y más de 200 genotipos, clasificados con base en las diferencias en la secuencia del gen que codifica para la proteína L1, la principal proteína estructural de la cápside viral. De acuerdo con la capacidad para producir infecciones persistentes, que llevan al desarrollo de lesiones premalignas o malignas, los diferentes tipos de VPH se agrupan en genotipos de bajo y de alto riesgo; estos últimos identificados con los números 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68  (9,10).

La mayoría de los genotipos conocidos se consideran de bajo riesgo, ya que se asocian con infecciones principalmente de carácter transitorio y limitadas, visualizadas como lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado, que son controladas, en su mayoría, por el sistema inmunológico (11). Por su parte, los genotipos de alto riesgo se relacionan con la inducción de lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado, las cuales, si no se tratan, pueden evolucionar hasta cáncer cervical al cabo de unos 10 a 20 años; razón por la que son considerados los reales agentes implicados en el desarrollo de lesiones premalignas cervicales y cáncer de cuello uterino (5,11)

Los dos genotipos de VPH de alto riesgo que han sido relacionados principalmente con las lesiones premalignas y el carcinoma de cérvix son el 16 y el 18. Por ejemplo, la positividad para VPH 16 oscila entre el 20% y el 28% de las citologías reportadas como normales o con lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado, y aumenta hasta el 47% y el 63% de citologías que reportan lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (5,11).

VPH LCH

A nivel mundial, se estima que el 75% de las personas sexualmente activas tendrán infección por VPH al menos una vez en la vida. En países en vía de desarrollo, la prevalencia de la infección se estima que es cercana al 14%, mayor que lo reportado en países desarrollados (10%) (11). Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la mayoría de las infecciones por VPH (90%) son transitorias y se resuelven espontáneamente en el primer o segundo año después de adquirida la infección (5). El aclaramiento de las infecciones tiene estrecha relación con el estado inmune, la predisposición genética y los niveles hormonales de la persona infectada, así como la reinfección o coinfección con otro genotipo del virus (7). Las infecciones causadas por genotipos virales de alto riesgo suelen resolverse entre 4 a 20 meses y las ocasionadas por genotipos de bajo riesgo  presentan una regresión más rápida (5,7,11).

VPH y carcinoma cervicouterino:

Existen dos mecanismos de acción del VPH sobre los epitelios escamosos de la piel y las mucosas. El primero corresponde a la infección transitoria y replicación viral en las células, utilizando la maquinaria celular para generar más partículas virales. Esta interacción es típicamente vista como una lesión intraepitelial escamosa de bajo grado, anteriormente llamada displasia leve o neoplasia intraepitelial grado 1 (NIC1). La segunda forma de interacción corresponde a las lesiones premalignas o precancerosas, las cuales se caracterizan por un descontrol entre la proliferación viral y la diferenciación celular epitelial. Es decir, hay una sobreexpresión del virus que origina el crecimiento rápido y descontrolado de células epiteliales indiferenciadas y que, morfológicamente, se observa como una lesión intraepitelial escamosa de alto grado, antes llamada neoplasia intraepitelial grado 2 (NIC 2) o neoplasia intraepitelial grado 3 (NIC 3) (5,11,12).

El objetivo principal del tamizaje por citología cervicouterina es la detección y el tratamiento oportuno de las lesiones premalignas, con el fin de disminuir la aparición de carcinoma invasor de cuello uterino, dado que hasta un 30% a 50% de las lesiones de alto grado pueden progresar en los siguientes 30 años a este tipo de cáncer (12).

Debido a la morbilidad y mortalidad derivadas del desarrollo de cáncer de cérvix, es de gran relevancia obtener información de los genotipos de VPH de alto riesgo presentes en los periodos de infección y persistencia mediante métodos que permitan realizar un tamizaje, diagnóstico y tipificación molecular confiable, como estrategia para la detección temprana y, en consecuencia, la reducción de la mortalidad asociada a este cáncer (13,14).

Pruebas de tamizaje:

El objetivo de los métodos actuales de tamizaje es detectar lesiones cervicales de alto grado y carcinomas cervicales no invasivos, para las cuales existe tratamiento exitoso y, así, evitar la progresión a carcinoma cervical invasor. Entre las opciones actuales se encuentran la citología cervicouterina y las pruebas moleculares para detección del ADN del VPH (14).

Citología cervicovaginal convencional:

La citología cervical convencional o Papanicolaou (PAP), desarrollada por George Papanicolaou, es considerada el método de tamizaje más costo-efectivo para detectar a tiempo las lesiones cervicales premalignas y evitar la progresión a lesiones malignas. Para esta, se toma una muestra de células del cérvix con espátula y citocepillo, la cual se extiende manualmente en un portaobjetos y se fija para su posterior coloración y estudio microscópico (8,15,16).

El sistema Bethesda es la guía estandarizada para la evaluación de citologías cervicouterinas a nivel mundial, provee los criterios relacionados con la calidad de la muestra y establece un reporte con criterios unificados. En este aspecto es fundamental entender que la terminología refleja el entendimiento actual de la biología de la afección del epitelio escamoso por el VPH, ya sea como infección viral o como lesión premaligna asociada al virus (8,17).

citología convencional

Citología cervico-uterina en base líquida:

En mayo de 1996, la citología en base líquida fue aprobada por la Administración de medicamentos y alimentos de los Estados Unidos (FDA). Esta decisión se realizó con base  en estudios que mostraron un aumento significativo en la detección de lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado o en lesiones más avanzadas, comparada con la citología convencional. Además, su uso, evidenció la reducción del número de muestras subóptimas o inadecuadas, y evitó la repetición de los frotis (15).

Esta técnica utiliza el mismo proceso que la convencional para la toma de la muestra de las células del cérvix, pero a diferencia de esta, la muestra se introduce en un recipiente con un medio conservador, a partir del cual se preparan las láminas para el análisis microscópico (15,18). Esto, resuelve algunos de los problemas de la técnica convencional de Papanicolaou, tales como la captura deficiente de la totalidad de la muestra, fijación insuficiente, distribución aleatoria de células anómalas, existencia de elementos perturbadores y mala calidad del frotis. Asimismo, facilita la lectura al eliminar sangre u otros artificios, lo que aumenta  el número de muestras satisfactorias para su valoración y ayuda a la mejor detección de las lesiones intraepiteliales. Finalmente, permite realizar de manera conjunta y usando la misma muestra, pruebas moleculares para la detección de VPH e inmunohistoquímica (15).

Citología cervico-uterina en base líquida

Diagnóstico molecular de VPH:

La relación causal entre el desarrollo del cáncer de cuello uterino y la infección con genotipos de alto riesgo de VPH ha llevado al desarrollo de estrategias para su detección y caracterización genotípica, como una medida de prevención del cáncer de cuello uterino. Dado que la presencia del VPH no puede ser determinada mediante los hallazgos morfológicos en la citología, la detección de anticuerpos específicos contra el VPH (pruebas serológicas) o criterios clínicos específicos, su detección y genotipificación recae en el uso de pruebas moleculares  (10,19,20)

Las pruebas moleculares para VPH, en su mayoría, están dirigidas a la detección del ADN de los genotipos de alto riesgo y son utilizadas como estrategias de diagnóstico, clasificación de las anormalidades citológicas de bajo grado (según el riesgo asociado al tipo de VPH identificado), evaluación de las infecciones persistentes, seguimiento postratamiento a una lesión intraepitelial escamosa de alto grado y vigilancia epidemiológica en salud pública a nivel nacional e internacional (10,19,20)

El alto valor predictivo negativo, junto con su alta sensibilidad, impulsó el uso de las técnicas de detección del ADN de VPH como pruebas primarias para el tamizaje de cáncer cervicouterino y, en combinación con los hallazgos detectados en la citología cervicouterina, estratificar el riesgo de enfermedad cervical grave y orientar la selección de tratamientos apropiados de acuerdo con la lesión cervical encontrada y el seguimiento requerido (19,20). El uso de la citología y las pruebas de detección de ADN de VPH en un enfoque combinado aumenta la sensibilidad del tamizaje cervicouterino (hasta el 90%) y reduce, de manera significativa, el riesgo de sufrir lesiones cervicales premalignas durante un periodo de 5 años (considerado a partir de un resultado negativo en la citología cervicouterina) (13)

Existen gran cantidad de pruebas moleculares de utilidad para la detección del ADN del VPH o su genotipificación directamente en muestras de citología. Poljak y colaboradores reportaron, para el año 2020, un total de 254 pruebas comerciales distintas disponibles para detectar el VPH (21). Estas pruebas, que se diferencian entre sí por el número y tipo de VPH que pueden detectar, su sensibilidad y especificidad clínica, y el tipo de tecnología que utilizan para la detección, pueden ser clasificadas principalmente en dos:

  • Pruebas de detección directa del ADN viral: basadas en técnicas de hibridación, incluidas algunas en desuso como la hibridación in situ, el southern blot y el dot blot, o amplificación de señal de los ácidos nucleicos como las pruebas de captura de híbridos.
  • Pruebas de amplificación de regiones específicas del ADN viral: la mayoría de ellas basadas en la técnica de reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) o en tiempo real (RT-PCR) para la amplificación de regiones específicas del ADN del VPH, entre ellas, los genes L1 (gen tardío que codifica para proteínas estructurales que conforman la nucleocápside del VPH), E6 y E7 (genes tempranos no estructurales) (9,22).  

La prueba molecular considerada como el estándar de referencia (”gold standard”) para la detección del VPH es la captura de híbridos (ADN-ARN). Existen dos pruebas comerciales basadas en la captura de híbridos y aprobadas por la FDA para la detección de VPH (23). Estas, permiten la detección del ADN de hasta 14 tipos de VPH de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) y hasta 5 genotipos de bajo riesgo (6, 11, 42, 43 y 44). A pesar de incluir genotipos de VPH considerados clínicamente relevantes, su ejecución es laboriosa y se limita únicamente a la detección (positivo/negativo) del VPH, agrupado como genotipos de alto riesgo o de bajo riesgo, sin permitir su genotipificación individual y específica, lo cual es de gran relevancia en el seguimiento de las infecciones persistentes, el monitoreo de programas de vacunación y en los programas y estudios de vigilancia epidemiológica (22).   

Las pruebas de captura de híbridos han mostrado ser de utilidad en el diagnóstico rutinario de VPH; sin embargo, existe gran cantidad de pruebas moleculares alternativas, de mejor sensibilidad y especificidad clínica, y menos laboriosas, las cuales permiten detectar, genotipificar y cuantificar el VPH en un mismo ensayo. Estas pruebas en su mayoría están basadas en la amplificación de regiones específicas de ADN del VPH (19,22)

Las pruebas de amplificación de ADN viral basadas en PCR y RT-PCR,en su mayoría diseñadas para la amplificación del gen L1, son de mejor sensibilidad y especificidad que la captura de híbridos, y permiten la genotipificación y cuantificación simultánea de múltiples genotipos del VPH. Además de permitir la caracterización individual de genotipos clínicamente relevantes (genotipos de alto riesgo), las pruebas de amplificación del ADN han sido acopladas a tecnologías y plataformas automatizadas que permiten reducir los costos y el tiempo de procesamiento de las muestras de citología, y de obtención de los resultados (10,19,21).    

AnyplexTM II es una prueba de PCR multiplex en tiempo real (RT-PCR) que permite la detección cualitativa (Positivo/Negativo) y simultánea de 14 genotipos de VPH. Esta prueba de RT-PCR permite la amplificación de una región específica del gen L1 del virus, la detección (usando sondas con marcaje fluorescente) y diferenciación (discriminación por genotipos) del ADN de los genotipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51 52, 56, 58, 59, 66, y 68 del VPH, clasificados como de alto riesgo para cáncer de cérvix (24,25)

Además de ser una prueba robusta, de alta sensibilidad y especificidad, la prueba de RT-PCR Anyplex II fue evaluada y validada clínicamente bajo guías y estándares internacionales de tamizaje y diagnóstico de cáncer de cérvix. Esta prueba puede ser aplicada directamente sobre muestras de citología en base líquida y es considerada como método de selección primaria para identificar mujeres con alto riesgo para el desarrollo de cáncer de cérvix o la presencia de enfermedad de alto riesgo. Igualmente, permite evaluar muestras de citología de pacientes con resultados atípicos en la citología cervical como el ASCUS (atipias de células escamosas de significado indeterminado), con el objetivo de determinar la necesidad de derivación a colposcopia o para apoyar el diagnóstico molecular de infecciones causadas por VPH (3,25).

Por qué elegir al Laboratorio Clínico hematológico:

En el Laboratorio Clínico Hematológico nos preocupamos por brindarte las mejores estrategias de tamización para prevenir el cáncer cervicouterino. Actualmente, ofrecemos, en todas nuestras sedes, alternativas para el acceso a la citología cérvico-uterina en base líquida, la cual se puede acompañar de manera conjunta con la prueba de RT-PCR AnyplexTM II para la detección y genotipificación del ADN de VPH de alto riesgo, usando una única muestra citológica. 

Asimismo,  contamos con personal experto y de la mejor calidad científica y humana, que garantiza el análisis e integración de los resultados de ambas pruebas para un asesoramiento personalizado. 

Nuestra infraestructura tecnológica y personal, nos permite ofrecer resultados rápidos y confiables de acuerdo con tus necesidades específicas. De forma adicional, estamos impulsando convenios para que puedas acceder al tamizaje por citología y detección del ADN de VPH desde consultorios de médicos ginecólogos aliados, para una mayor comodidad y fácil acceso a nuestros servicios.

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